摘要
目的 优化莞香茶总黄酮的超声波辅助提取工艺和评价莞香茶总黄酮清除亚硝酸盐的效果。方法 以莞香茶为试样，乙醇为溶剂，用响应面法确定总黄酮的最佳超声提取工艺；同时比较莞香茶、新鲜莞香叶和其他常见发酵茶总黄酮含量及其清除亚硝酸盐的能力。结果 响应面法预测的最佳提取条件为：乙醇体积分数 61.98%，超声温度 57.92 ℃，超声时间 3.47 h，提取率预测值为 2.76%，与实测值 2.74% 基本一致。在最佳提取条件下测得 3 个品牌莞香茶和新鲜莞香叶总黄酮提取率分别为2.48%、2.69%、2.79%和2.54%。不同茶叶中的总黄酮清除亚硝酸盐效率由高到低排序为莞香茶 3（72.85%）、莞香茶 2（71.06%）、乌龙茶 1（70.93%）、新鲜莞香叶（70.35%）、乌龙茶 2 （大红袍）（69.39%）、红茶 2（69.38%）、普洱茶（68.87%）、莞香茶 1（67.14%）、红茶 1（40.38%）。结论 莞香茶在乙醇体积分数61.98%、超声温度57.92 ℃、超声时间3.47 h时提取总黄酮的效率好，清除亚硝酸盐的效果佳。
Abstract
Objective To optimize the ultrasonic-assisted extraction technology and evaluate the nitrite-scavenging ability of total flavonoids from Guanxiang Tea. Methods The paper took Guanxiang Tea into the ethanol, used response surface methodology to determine the optimal ultrasonic extraction technology for total flavonoids. At the same time, the total flavonoid content and nitrite-scavenging ability of Guanxiang Tea, fresh Guanxiang leaves and other common fermented teas were compared. Results The results showed that the optimal extraction conditions predicted by the response surface experiment were: ethanol concentration of 61.98%, ultrasonic temperature of 57.92 °C, ultrasonic time of 3.47 h, the predicted extraction rate of 2.76%, which was in agreement with the measured value of 2.74%. Under the optimal extraction conditions, the extraction rates of total flavonoids from three brands of Guanxiang Tea and fresh Guanxiang leaves were 2.48%, 2.69%, 2.79%, and 2.54%. The removal efficiency of total flavonoids in different tea from high to low was as follows: Guanxiang tea NO.3 (72.85%), Guanxiang tea NO.2 (71.06%), Oolong tea NO.1 (70.93%), fresh Guanxiang leaves (70.35%), Oolong tea NO.2 (Dahongpo) (69.39%), black tea NO.2 (69.38%), Puer tea (68.87%), Guanxiang tea NO.1 (67.14%) and black tea NO.1 (40.38%). Conclusion At ethanol concentration of 61.98%, ultrasonic temperature of 57.92 ℃ and ultrasonic time of 3.47 h, the extraction efficiency of total flavonoids was good, and the removal of nitrite was good.
莞香树为瑞香科沉香属乔木，属国家二级保护植物，学名是土沉香，又常被称作白木香，被国家质量监督检验检疫总局认定为地理标志产品，在东莞地区尤为珍贵，不仅作为药用植物被广泛应用，还因其珍稀性而具有显著的经济价值[1]。莞香产业具有巨大的市场潜力，至 2019 年，东莞的莞香产业规模已接近 20 亿元[2]。经过一系列研究，科学家们发现莞香叶富含多种活性成分，包括多糖、有机酸、氨基酸、黄酮苷类及酚类等[3-8]，这些成分具有降血脂、抑菌、抗氧化、增强免疫和抗病毒等多重功效[9-11]。然而，莞香叶并非传统药用部位，其科学研究起步较晚、产品开发应用相对较少，主要以莞香茶的形式存在[12-13]。莞香茶，作为东莞地区的特色产品之一，是通过独特传统发酵工艺制成，备受欢迎。陈地灵等[14] 对沉香茶（莞香茶的一种）的水浸液进行了体外抗氧化和体内降血脂的探究，发现其具有良好的抗氧化能力和一定的降血脂效果。韩卫娟[15] 发现沉香茶能够修复因自由基损伤造成的 DNA 损伤，显示出其潜在的保健价值。本团队也针对莞香茶进行了初步研究，发现其黄酮类化合物对亚硝酸盐具有良好的清除作用[16-17]。然而，罗翔宇等[16] 的提取方法仅采用了单因素法，其局限性较大，可能并未得到莞香茶黄酮的最优提取条件。为深入研究莞香茶中总黄酮的最佳提取条件，我们对比了莞香茶与市面上常见的 5 种发酵（或半发酵）茶中总黄酮含量及其清除亚硝酸盐的能力，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 茶叶样品
3 种莞香茶；新鲜莞香叶，2020 年采自东莞市大岭山镇莞香种植基地；5种发酵茶，即 2种乌龙茶、2种红茶、1种普洱茶。
1.1.2 试剂
芦丁标准品（≥ 98%，北京索莱宝科技有限公司）；硝酸铝、无水乙醇、盐酸萘乙二胺（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）。
1.1.3 仪器
紫外可见分光光度计（UV-1800 型，美谱达仪器公司）；超声清洗仪（G-3024GH，歌能公司）；烘箱（101-3B，上海昕仪仪器仪表有限公司）；电子天平（FB224，上海皓拂仪器仪表有限公司）；旋涡振荡仪（Vortex.Genie2，美国SI公司）；中药材粉碎机 （JB-05，伊贝诺公司）；不锈钢筛子（60 目，晨兴公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 样品预处理
3 个品牌莞香茶、新鲜莞香叶和 5种发酵茶分别清洗干净后于40℃烘箱中烘干，然后置于干燥器中自然冷却，再用粉碎机粉碎、过筛（60目），装入密封袋置于干燥器中备用。
1.2.2 莞香茶总黄酮提取工艺流程
称取一定质量的茶粉，加入到一定体积一定体积分数的乙醇溶液中，置于 400 w 的超声清洗仪中超声提取一定的时间后过滤取上清液。
1.2.3 单因素实验
单因素实验参考前期发表的论文[16]，实验过程大致如下。
（1）乙醇体积分数对莞香茶总黄酮提取率的影响：1 g 茶粉+15 mL 乙醇 + 超声温度 40℃ +超声 3.5 h，乙醇体积分数分别设置为 40%、50%、60%、 70%和80%，分光光度法测定总黄酮含量。
（2）茶叶（料）/乙醇（液）对莞香茶总黄酮提取率的影响：1 g茶粉 + 60% 乙醇 + 超声温度 40℃ + 超声 3.5 h，乙醇体积分别设置为 15、20、25、30 mL，分光光度法测定总黄酮含量。
（3）超声温度对莞香茶总黄酮提取率的影响： 1 g 茶粉+15 mL 60% 乙醇+超声 3.5 h，超声温度分别设置为40、50、60、70、80℃，分光光度法测定总黄酮含量。
（4）超声时间对莞香茶总黄酮提取率的影响： 1 g 茶粉 + 15 mL 60% 乙醇 + 超声温度 40℃，超声时间分别设置为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4 h，分光光度法测定总黄酮含量。
1.2.4 响应面法
根据单因素实验结果选择影响程度较大的 3 因素 3 水平作为试验因素，以总黄酮含量作为响应值，根据Box-Benhnken 中心组合实验设计原理采用 Design-Expert 8.0.6 进行响应面优化分析，具体如表1所示。
1.2.5 总黄酮含量的测定
根据《GB/T20574-2006 蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法》测定总黄酮的含量（%），即 1 g 茶叶中含有总黄酮的质量。
1.2.6 总黄酮清除亚硝酸盐能力实验
亚硝酸盐清除实验参考张亚安等[18] 发表文章中的方法，实验过程大致如下：准确吸取总黄酮提取液 0.25 mL 于 10.0 mL 比色管中，分别加入磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液（pH=3）1 mL和 5 mg/L 的 NaNO2溶液各 1 mL，在 37℃水浴 30 min 后取出，马上加入 0.4% 对氨基苯磺酸1 mL摇匀后静置3 min，再加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液 0.50 mL，用水稀释到刻度处后静置 15 min。在 545 nm波长处，以等量的总黄酮提取液作参比溶液，测定样品吸光度（Ax）。同时以蒸馏水代替样品，测定样品空白吸光度（A0），按下式计算清除率。
表1Box-Behnken试验设计
1.3 数据处理
每个样品测量 3 次，取其平均值作为最终测定结果。实验数据采用 Microsoft Office Excel 2010、 SPSS 19.0 和 Design-Expert V8.0.6 数据分析工具进行处理。
2 结果
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇浓度对莞香茶总黄酮提取率的影响
乙醇在 40%~80% 范围内对莞香茶总黄酮提取率的影响如图1所示。由图可知，当乙醇体积分数分别为 40%~80% 时，莞香茶总黄酮提取率分别为 1.89%、2.41%、2.68%、2.62% 及 2.55%，提示乙醇体积分数为60%时，莞香茶总黄酮提取率最佳。
2.1.2 茶叶（料）/乙醇（液）对莞香茶总黄酮提取率的影响
茶叶（料）/乙醇（液）对莞香茶总黄酮提取率的影响如图2所示。由图可知，当料液比分别为1 ∶10、1∶15、1∶20、1∶25 及 1∶30 时，莞香茶总黄酮提取率分别为 2.39%、2.73%、2.52%、2.53% 及 2.40%，提示当料∶液低于 1∶15 这一临界点时，莞香茶总黄酮的提取率便不再显著增加。
图1不同乙醇体积分数对莞香茶总黄酮提取率的影响
图2不同料液比对莞香茶总黄酮提取率的影响
2.1.3 超声温度对莞香茶总黄酮提取率的影响
超声温度对莞香茶总黄酮提取率的影响如图3所示。由图可知，当超声温度与乙醇体积分数分别为 40~80℃ 时，莞香茶总黄酮提取率分别为 1.84%、 2.51%、2.63%、2.58% 及 2.39%，提示超声温度对黄酮提取率的影响十分明显。
图3不同超声温度对莞香茶总黄酮提取率的影响
2.1.4 超声时间对莞香茶总黄酮提取率的影响
超声时间对莞香茶总黄酮提取率的影响如图4所示。由图可知，当超声提取时间为 0~3.5 h时，莞香茶总黄酮提取率分别为 1.69%、1.87%、2.00%、2.13%、 2.27%、2.46%、2.69% 及 2.25%，提示超声时间的长短对莞香茶总黄酮的提取率具有显著影响。
图4不同超声时间对莞香茶总黄酮提取率的影响
2.2 响应面法
2.2.1 响应面设计及结果
根据单因素实验结果，我们选取乙醇体积分数、超声温度和超声时间 3 种因素的各 3 个水平，以莞香茶总黄酮提区率作为响应值，设计实验因素与水平表（如表2）。试验设计及结果见表3。
2.2.2 模型的建立及其显著性检验
采用 Box-Behnken法以 Design-Expert 8.0.6 进行数据分析，对表3数据进行拟合，得到以下二次多项回归方程：Y=-2.73A2-2.69B2-2.71C2-0.063AB-0.035AC-0.21BC+0.076A-0.080B-0.064C+7.74。式中Y为总黄酮提取率（%），A 为乙醇体积分数（%），B 为超声温度（℃），C为超声时间（h）。回归模型各项系数的显著性检验结果和方程的方差分析结果见表4。根据响应面法的原理[19] 分析表4结果可知，该回归模型是显著的（P<0.01），回归模型的决定系数 R2 = 0.999 9 与校正决定系数 R2 adj = 0.999 8 接近，失拟项P=0.1423>0.05，说明该回归模型与实验数据拟合程度高，误差小。因此，可以用该模型分析和预测莞香茶总黄酮的提取效果。模型中的 A、B、C、AB、 BC、A2、B2、C2 差异极显著，AC项差异不显著。A、B 的 P 值一致，说明 A、B 影响程度极度相似，均大于 C。从F值可得3个因素对得率的影响程度为A >B >C，即乙醇体积分数>超声温度>超声时间。
表2响应面因素及水平表
表3Box-Behnken试验设计及结果
表4响应面法结果方差分析表
2.2.3 响应面分析与工艺优化
用 Design-Expert软件对表3数据进行三元二次回归拟合，各两因素交互作用响应面图如图5~7所示。从图中可知，乙醇体积分数（A）的曲面相对超声温度（B）的曲面相较陡，超声温度（B）的曲面相对超声时间（C）较陡。综上，确定回归模型预测的最佳工艺条件为：乙醇体积分数61.98%，超声温度57.92℃，超声时间3.47 h，提取率预测值为2.76%。考虑到实际的操作条件，确定总黄酮提取的最优工艺为：乙醇 60%、超声温度 60℃、料∶液为1∶15、超声时间3.5 h。在此条件下管香茶总黄酮提取率为 2.74%（n=5），与理论值 2.76% 较为接近，提示在此优化条件下提取莞香茶内总黄酮效果好。
图5超声温度与乙醇体积分数对莞香茶总黄酮提取率的影响
图6超声时间与超声温度对莞香茶总黄酮提取率的影响
图7超声时间与乙醇体积分数对莞香茶总黄酮提取率的影响
2.3 不同品牌莞香茶与新鲜莞香叶总黄酮含量比较
在预测的最佳工艺条件下提取不同品牌莞香茶以及新鲜莞香叶的总黄酮，结果如图8所示。由图可知，莞香茶 1、莞香茶 2 和莞香茶 3 的总黄酮提取率分别为 2.48%、2.69% 和 2.79%，新鲜莞香叶总黄酮提取率为2.54%。
图8不同品牌莞香茶及新鲜莞香叶中总黄酮含量比较
2.4 莞香茶与其他发酵茶总黄酮清除亚硝酸盐能力比较
用预测的最佳工艺条件分别提取不同品牌莞香茶、新鲜莞香叶及其它常见发酵茶的总黄酮，然后进行清除亚硝酸盐能力，结果详见图9。由此可知，不同茶叶中的总黄酮清除亚硝酸盐效率由高到低排序为莞香茶 3（72.85%）、莞香茶 2（71.06%）、乌龙茶 1（70.93%）、新鲜莞香叶（70.35%）、乌龙茶 2 （大红袍）（69.39%）、红茶 2（69.38%）、普洱茶 （68.87%）、莞香茶 1（67.14%）、红茶 1（40.38%）。其中莞香茶总黄酮含量与清除亚硝酸盐的能力存在明显的量效关系，清除效率从高到低依次为莞香茶 3（72.85%）、莞香茶 2（71.06%）、新鲜莞香叶 （70.35%）、莞香茶 1（67.14%），与其总黄酮含量（从高到低）的排序一致，且新鲜莞香叶的亚硝酸盐清除效率与莞香茶 3、莞香茶 2比较，差异不明显。为更加全面地评价莞香茶清除亚硝酸盐的能力，我们还将莞香茶黄酮与 5 种常见发酵茶中总黄酮清除亚硝酸盐效果作对比。除了莞香茶 1，其余两个品牌的清除能力比其他茶种更强，其中，莞香茶 3 更是比红茶1高出1.8倍。对比于其他常见发酵茶，本研究的结果提示虽然新鲜莞香叶中含有丰富的总黄酮，但不同的制作工艺、茶叶的产地及年份等因素均会影响茶叶中的总黄酮含量及其清除亚硝酸盐的能力。
图9莞香茶与5种发酵茶中的总黄酮对亚硝酸盐清除能力比较
3 讨论
本研究发现乙醇体积分数、料/液、超声温度、超声时间等因素均可影响莞香茶中总黄酮的提取，且通过响应面法可获得莞香茶总黄酮的最佳提取条件。
乙醇体积分数在 40%~60% 时，乙醇的增加可提高提取率，可能与其提升黄酮类化合物溶解度有关[19]。而当乙醇体积分数过高时，又会使得一些醇溶性杂质和色素等物质的浸出量增多，上述这些物质结合乙醇-水分子，与黄酮类化合物形成竞争关系，最终导致黄酮的提取率出现下降[20]。此外，乙醇体积分数过高，其成本也增加。综合上述因素，选择乙醇体积分数为 60% 时是一个比较合适的平衡点。而本研究结果与课题组前期结果[16] 相似，说明方法重复性好。
料/液为1/15时莞香茶总黄酮的提取率最佳，这一现象背后的原因可能是当料/液达到1/15时，莞香茶中的黄酮成分已基本被完全溶解出来[20]。
已知温度升高，分子的运动速度加快，分子的扩散能力增强，可能是这种扩散能力的提升增加了黄酮分子与乙醇水溶液相互接触的机会，从而使得黄酮类化合物更易溶出[19]。当超声温度超过 60℃ 时，黄酮提取率会略有降低，这可能是由于高温条件下，黄酮中的部分热不稳定化合物可能发生氧化反应[20]，进而影响了黄酮的提取效率，导致其提取率下降。综合考虑，莞香茶总黄酮在超声温度为60℃ 时为适宜。
较短的超声时间无法使黄酮充分溶出，导致提取率偏低。而过长的超声时间又可能引发问题，如部分黄酮的氧化和分解，从而同样降低提取率。此外，长时间的超声还会促使蛋白质、糖类等大量溶出[20]，这无疑增加了后续分离工作的难度。综合考虑，建议提取莞香茶总黄酮时超声3.5 h为宜。
响应面法可以通过拟合各个因素与响应值的关系，模拟得到最佳的实验条件，该方法直观、全面、快捷，被广泛运用在各种物质的提取工艺优化中[21-22]。包芮宁等[23] 用响应面法发现乙醇体积分数对魔芋葡甘聚糖含量的影响大于超声时间；而王育红等[24-25] 用响应面法研究提取黄酮工艺的结果提示超声温度的影响大于超声时间，我们的结果与其相似。
3 个品牌莞香茶中的总黄酮含量与新鲜莞香叶中的有微小差异，可能是因为不同厂家莞香叶的发酵工艺不同，使得制得的莞香茶黄酮总量稍有变化。此外，总黄酮提取率的差异还有可能源于不同品牌茶叶产地和采摘时间的差异。截至2018年，东莞全市共种植莞香树大约 2 万亩，数量超过 120 万株，主要集中在大岭山、寮步、清溪、凤岗、樟木头和东莞植物园[2]，而不同种植基地的种植方式和土地条件等因素对莞香叶的品质也会产生影响。
本实验采用响应面法优化得到莞香茶黄酮的最佳提取条件[60%乙醇、60℃、料液比1∶15（g∶mL）、 3.5 h]，3个品牌莞香茶和新鲜莞香叶总黄酮提取率分别为 2.48%、2.69%、2.79% 和 2.54%，亚硝酸盐的清除率分别为 67.14%、71.06%、72.85% 和 70.35%，其中莞香茶3、莞香茶2清除亚硝酸盐能力均优于乌龙茶、红茶和普洱茶。